Повна версія

Головна arrow Екологія arrow ЕКОЛОГІЧНИЙ МОНІТОРИНГ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   ЗМІСТ   >>

БІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ

Біологічний метод аналізу заснований на тому, що для життєдіяльності - зростання, розмноження і взагалі нормального функціонування - живих істот необхідне середовище чітко визначеного хімічного складу. При зміні цього складу, наприклад при виключенні з середовища будь-якого компонента або введення додаткового (визначається) з'єднання, організм через якийсь час видає відповідний сигнал. Встановлення характеру зв'язку або інтенсивності сигналу у відповідь організму з кількістю введеного в середу або виключеного з неї компонента служить для його виявлення і визначення.

У біологічному методі аналітичними індикаторами служать різні живі організми, їх органи та тканини, фізіологічні функції і т.д. У ролі індикаторного організму виступають мікроорганізми, безхребетні, хребетні, рослини.

Всі речовини по відношенню до живих організмів поділяють на такі:

  • • життєво необхідні;
  • • токсичні;
  • • фізіологічно неактивні.

Очевидно, що тільки в двох перших випадках можна очікувати порівняно швидку реакцію організму.

Від характеру визначається речовини залежить вибір того чи іншого індикаторного організму. Його відповідний сигнал на зміну хімічного складу твердої, рідкої або повітряного середовища може бути найрізноманітнішим: зміна характеру поведінки, інтенсивності росту, швидкості метаморфоз, складу крові, біоелектричної активності органів і тканин, порушення функцій органів травлення, дихання, розмноження. Узагальненим показником ефективності дії визначається з'єднання на індикаторний механізм є або виживання, або летальний результат.

Чим складніший організм, тим більше число його життєвих функцій можна використовувати в якості аналітичних індикаторів, тим вище інформативність біологічного методу аналізу. Діапазон визначених змістів, межа виявлення сполук біологічним методом залежить від спрямованості і тривалості впливу хімічної сполуки на організм, температури і pH середовища, рівня організації індикаторного організму, його індивідуальних, вікових та статевих особливостей.

Мікроорганізми. При використанні мікроорганізмів (бактерій (рис. 9.2), дріжджів, водоростей, цвілевих грибів) спостерігають, як зі зміною хімічного складу живильного середовища змінюється динаміка зростання окремої клітки і популяції в цілому, і порівнюють з контрольним досвідом. Інтенсивність росту (розмноження, пригнічення) популяцій оцінюють найчастіше оптичними або електрохімічними методами.

мікроорганізми

Мал. 9.2. мікроорганізми:

а - бактерії; 6 - водорості

Гриби як аналітичні індикатори широко використовують при аналізі грунтів на вміст таких елементів, як цинк, мідь, марганець, залізо, молібден, фосфор, вуглець, азот, сірка та ін.

Ростові реакції мікроорганізмів, що змінюються під дією різних хімічних сполук, застосовують при аналізі природних і стічних вод. З використанням бактерій і дріжджів розроблений дифузний метод виявлення в стічних водах фенолів, нафтопродуктів, фосфорорганічних сполук.

Безхребетні. Відповідними сигналами безхребетних на зміну хімічного складу середовища є роздратування, що приводить до змін рухових реакцій, швидкість розмноження, характер харчування, інші біохімічні і фізіологічні зміни організму.

Найбільш вивченими для використання в аналітичних цілях є інфузорії. З їх допомогою можна визначати ТМ.

Водних безхребетних - ракоподібних (найчастіше рачків, дафнії, рис. 9.3) - широко застосовують для оцінки санітарно-гігієнічного складу води. В якості вихідного сигналу в цьому випадку використовують деякі фізіологічні показники: виживання, частоту руху ніжок, період скорочення серця (у дафній), забарвлення тіла загиблих організмів і т.д.

безхребетні

Мал. 9.3. безхребетні:

а - дафнія; б - рак

Хребетні. Класичними індикаторними організмами, широко використовуються для вирішення багатьох медико-біологічних проблем, є амфібії. На ізольованих органах і тканинах жаби (рис. 9.4) або на всьому організмі перевіряють фізіологічну активність багатьох фармацевтичних препаратів. Біопотенціал нервової тканини можна використовувати як індикатор для визначення концентрації кислот і лугів, деяких ТМ.

Амфібії

Мал. 9.4. Амфібії: а - жаба; 6 - тритон

При оцінці якості середовища, яку можна проводити різними способами, найбільш важливим є відповідь на питання, який стан популяції живих істот, спільнот і екосистем. Сучасні аналітичні методи дозволяють визначити концентрацію токсичних сполук. Однак з їх допомогою можна визначити ступінь небезпеки забруднення для людини і для екосистеми в цілому. Тим більше, неможливо передбачити, як буде діяти суміш різних ксенобіотиків. Тому при моніторингу ОС в обов'язковому порядку передбачається тестування з використанням чутливих до ксенобіотиків живих організмів (найпростіші, риби і ін.).

Поряд з біотестуванням існують спеціальні методи комплексної діагностики стану довкілля, які включають в себе морфогенетические (генний аналіз, морфологічні і анатомічні зміни і ін.), Біофізичні і біохімічні (біолюмінесценція, фотосинтетична активність та ін.), Біоенергетичні та імунологічні, токсикологічні та ембріологічні , популяційні і еко- системні методи. Оскільки біодіагностіческіе методи забезпечують достовірну оцінку якості ОС і, головне, її придатності для життя, Біодіагностика є обов'язковим компонентом комплексної оцінки стану довкілля.

Біологічний моніторинг являє собою стеження за біорізноманіттям: наявністю видів, їх чисельністю і станом, появою не властивих для даних екосистем видів і т.д.

При біомоніторііге якості ОС використовують біоіндикаторів - організми або співтовариства організмів, присутність, кількість або особливості розвитку яких служать показниками природних процесів, умов або антропогенних вимірів середовища проживання. Багато організмів дуже чутливі і вибагливі по відношенню до різних факторів середовища проживання (хімічним складом грунту, вод, атмосфери, присутності інших організмів і т.п.) і можуть існувати тільки в певних, часто вузьких межах зміни цих факторів.

Існують різні методи біотестування:

  • • фітологіческое картування - картування числа видів і ступеня проективного покриття і порівняння з еталоном, в якості якого зазвичай використовують заповідні території;
  • • експозиція в забрудненому середовищі рослин або тварин-біоінді- індикатором і порівняння їх з вирощеними в нормальних умовах;
  • • аналіз змін в складі і чисельності видів і співтовариств;
  • • аналіз видимих пошкоджень організмів і ін.

В особливо великих масштабах біоіндикаторів спостерігають у водних організмах, де коефіцієнт накопичення забруднювачів по відношенню до його вмісту в воді може досягати 10 3 -10 4 і більше. Багато організмів засвоюють забруднювачі селективно. Так, деякі види їстівних грибів накопичують кадмій, морські багатоклітинні організми асцидії - ванадій, а морські одноклітинні радіолярії і кріп звичайний - ізотопи стронцію.

Розглянемо методи біологічного моніторингу більш докладно.

Морфогенетические методи. Флуктуірует асиметрія - невеликі ненаправлення відмінності між правою і лівою сторонами різних морфологічних структур, в нормі що володіють билатеральной симетрією. При цьому аналізі досліджують різницю між кількісними ознаками (числом шипиків, члеників, плям і т.п.) на правій і лівій половинах тіла у тварин, узятих із забруднених і чистих (контрольних) територій.

Фенодевіанти - фенотип, тобто варіанти прояву ознаки, що відрізняються від нормального, що зазвичай зустрічаються в природі. Їх поява зазвичай є результатом значних порушень розвитку.

Наприклад, забруднення ТМ збільшує число суцвіть у поповник звичайного з малим числом язичкових квіток.

Фрактал-аналіз дає можливість за допомогою математичного апарату досліджувати порушення в складних процесах формоутворення, закономірності яких протягом всього періоду життя залишаються постійними, тобто можуть бути описані однією і тією ж системою рівнянь. Наприклад, розташування кілець на лусці риб уздовж поздовжньої осі представляє собою складну хвильову структуру, фрактал-коефіцієнт якої зменшується при посиленні стресових впливів.

Генетичні методи. Аналіз генетичних змін використовують для оцінки стану навколишнього середовища. Прояв таких змін характеризує мутагенну активність ОС, а можливість їх збереження в клітинних популяціях відображає ефективність імунної потенції організму.

У нормальних умовах більша частина генетичних аномалій видаляється з популяції за допомогою імунної системи організмів. Наявність таких аномалій можна використовувати як індикатор стресу, ведучого до продукції аномальних клітин і зниження здатності імунної системи організму їх знищувати. Як генетичних змін в соматичних (від грец. Стара - «тіло») клітинах зазвичай розглядають різні структурні зміни хромосом, а також аномалії в кількості хромосом (анеуплоїдії) і поява стійких анеуплоїдних клонів.

Біофізичні та біохімічні методи. Біолюмінесценція - це видиме світіння живих організмів, пов'язане з процесами їх життєдіяльності і обумовлене у значної кількості видів ферментативним окисленням особливих речовин - люциферином (від лат. Lusifer - «світлоносний») (див. Параграф 6.3). Вона широко поширена в природі і відома у бактерій, грибів, представників різних типів тварин - від найпростіших до хордових.

У багатоклітинних організмів (ракоподібних, комах, риб і ін.) Світіння часто обумовлено симбиотическими бактеріями. Світіння можуть випускати вся поверхня тіла або спеціальні органи. Найчастіше в якості біоіндикаторів використовують морські люмінесцентні бактерії.

Біолюмінесцентного методи мають гарну чутливістю до різноманітних хімічних сполук, характерним для промислових скидів, забруднень грунту, води, повітря (ТМ, феноли, формальдегід, пестициди і т.д.).

Фотосинтез - перетворення зеленими рослинами і фотосинтезуючими мікроорганізмами променевої енергії Сонця в енергію хімічних зв'язків органічних речовин. Інтенсивність і характер фотосінтетіче- ської активності є найважливішими показниками фізіологічного стану рослин і здоров'я людини.

Одним з основних способів оцінки інтенсивності процесів фотосинтезу є флуометр, заснована на вимірі інтенсивності люмінесценції хлорофілу на довжині хвилі 690 нм. У випромінюванні Сонця ця довжина хвилі представлена з найбільшою інтенсивністю, що свідчить про адаптацію живих організмів в процесі еволюції до сонячного світла.

Флуоресцентний метод дозволяє контролювати сумарну кількість органічних речовин у воді за величиною інтегральної флуоресценції в області 390-560 нм. За допомогою цього методу можна визначати вміст нафтопродуктів у воді на довжині хвилі 460-480 нм з межею виявлення 10 _6 %.

Терпеноїди ( ізопреноїди) - природні сполуки з груп ліпідів, похідні від терпенів (група переважно ненасичених вуглеводнів складу (С 5 Н 8 ) І , де п> 2), присутні у всіх організмах, що утворюються з мевалонової кислоти. Ця група хімічних сполук характеризується величезним структурним різноманітністю, обумовленим складними окислювально-відновними процесами, ізомерними перебудовами і ін. Вони є активними учасниками обмінних процесів, що протікають в рослинах.

Аналіз структурного розмаїття терпеноидов у рослин може служити чутливим неспецифічним тестом на вплив різних чинників ОС. Збільшення різноманітності терпеноидов в листі рослин свідчить про порушення і збої в протіканні важливих фізіологічних процесів, таких як фотосинтетична активність.

Супероксидні радикали - продукти одноелектронного відновлення кисню, утворюються в ході нормального метаболізму у всіх аеробних організмів. Під дією різних факторів - радіації, гінероксіі, дії ксенобіотиків та ін. - їх кількість в клітині може збільшуватися. Супероксідантние радикали і продукти їх перетворення можуть стати серйозною загрозою для життєдіяльності - викликати інактивацію ферментів, пошкодження нуклеїнових кислот, деградацію полімерів і порушення проникності мембран.

Рівень вмісту в клітині супероксидних радикалів контролюється ферментом супероксиддисмутазой (СОД). Її активність індукується підвищенням рівня освіти супероксидних радикалів. За результатами вимірювання рівня СОД в клітинах можна оцінити, чи схильна організм оксідантовому стресу.

Біоенергетичні методи засновані на тому, що будь-який фізіологічний процес вимагає витрат енергії. Кількість енергії, що витрачається організмами на всі фізіологічні процеси в одиницю часу, є відображенням інтенсивності енергетичного метаболізму, яка може бути виміряна методом респірометріі. Такі аналізи дозволяють встановити ранні зміни в фізіологічному гомеостазі. Кількість енергії, що витрачається на процеси росту особини в стресових умовах, завжди вище, ніж в оптимальних, через додаткових витрат енергії на компенсацію цих впливів. Таким чином, кількість енергії, що витрачається під час росту, є характеристикою якості ОС.

Імунологічні методи аналізу засновані на специфічному зв'язуванні визначається з'єднання - антигену відповідними антитілами (специфічними білками крові, що утворюються в результаті імунологічних процесів, спрямованих на видалення з організму антигенів - генетично чужорідних тіл). Імунохімічний реакція в розчині між антитілами і антигенами - це складний процес, що протікає в кілька стадій. У імунохімічної аналізі принципово можливе використання тільки першої стадії, якій є оборотне утворення комплексів складу 1: 1.

Класичні методи иммунохимического аналізу засновані на утворенні осаду антитілами в присутності антигену. При цьому за протіканням цього процесу зазвичай спостерігають візуально і виявляють або напівкількісної визначають відносно високі концентрації антигену. Ці методи тривалі і трудомісткі.

Визначення малих концентрацій комплексу «антиген - антитіло», що утворилися в розчині, стає можливим, якщо в один з вихідних компонентів реакційної системи (антиген або антитіло) ввести мітку, яку легко детектувати СІ. Оскільки комплекс між визначеним з'єднанням (антигеном) і специфічним антитілом утворюється строго стехіометрично, експериментально встановлюється концентрація мітки, що входить до складу утворюється імунохімічного комплексу, безпосередньо пов'язана з концентрацією антигену.

Найчастіше в імунохімічної аналізі використовують ізотопні, флуоресцентні, ферментні, парамагнітні мітки, які підвищують чутливість иммунохимических методів в мільйони разів і скорочують час аналізу.

Імунохімічні методи аналізу все активніше впроваджують в аналітичну практику і застосовують в різних областях медицини, сільського господарства, мікробіологічної та харчової промисловості, при аналізі об'єктів ОС.

Паталого-анатомічні та гістологічні методи. Гістологічне дослідження внутрішніх органів є методом виявлення впливу сильних токсикантів. При їх впливі відбуваються серйозні перебудови в структурі і функції клітин, які можуть бути зареєстровані на тканинному рівні. Найбільш небезпечними наслідками подібних перебудов є злоякісний ріст клітин, їх дегенеративні зміни або поява некротичних вогнищ - відмирання клітин.

Окремо слід відзначити важливість вивчення репродуктивної системи, будь-які зміни якої безпосередньо пов'язані з життєво важливими параметрами популяцій. Репродуктивна система дуже чутлива до стресів, і будь-яке порушення розвитку статевих клітин і гонад можна розглядати як сигнал про наявність несприятливих змін ОС.

Токсикологічні методи мають на увазі оцінку токсичних властивостей речовин з використанням модельних живих систем. Оцінку токсичності проводять в лабораторних умовах для нормування, токсикологічного контролю, аналізу загальних закономірностей дій токсичних речовин і т.п.

При використанні цих методів до основних показників відносять загальні показники зростання, виживання, плодючості і якості потомства.

Як тест-систем зазвичай використовують культури водних організмів: ракоподібних (дафнії), водоростей і бактерій.

Ембріологічні методи базуються на тому, що найбільш уразливими до впливу зовнішніх факторів є ранні стадії розвитку багатоклітинних організмів. На стадіях розподілу і формування зародкових органів і тканин навіть незначні дії, як правило, призводять до видимих потворності на більш пізніх стадіях розвитку або навіть загибелі зародка. Як тест-об'єктів зазвичай використовують швидко і дають численне потомство тварин (риби, молюски, земноводні, комахи).

Ембріологічні методи служать дуже тонким індикатором для діагностики, в тому числі і для кількісних оцінок стану навколишнього середовища.

Популяційні і екосистемні методи. Для моніторингу довкілля в якості популяційних і екосистемних методів використовують аналіз стану таких показників, як чисельність і біомаса окремих видів, віковий і статевий склад популяцій, просторове розміщення окремих компонентів біологічних співтовариств, видовий склад і видове різноманіття співтовариств, співвідношення в спільнотах різних видів і їх розподіл за кількістю або біомасі, співвідношення численностей і біомас видів в екосистемах.

Видове різноманіття - одна з найважливіших характеристик спільноти, що відображає складність його видової структури. Видове різноманіття включає в себе два компоненти:

  • 1) видове багатство (насиченість спільноти видами);
  • 2) вирівняні ™ видової структури (ступінь рівномірності розподілу видів за кількістю). Кількісними заходами видового різноманіття є різні (більш 30) індекси.

Рангове розподіл - розподіл видів (або інших груп) за кількістю, де види ранжовані у напрямку зниження їх достатку. У будь-якому співтоваристві є види більш рясні і більш рідкісні, причому рясних зазвичай менше, ніж рідкісних. Вид рангового розподілу описується емпіричним законом, що відповідає природі даного екологічного об'єкта.

СІ, використовувані при біологічному моніторингу, досить великі і багато в чому аналогічні використовуваним в аналітичних методах контролю.

У біохімічних тест-методах на матриці иммобилизируют різні ферменти, антигени або антитіла. Біотести дозволяють контролювати вміст патогенів в природних, питних водах і ін.

Одним з таких биотестов є система швидкої індикації патогенів, яка призначена для виявлення рухомих бактерій роду Salmonella в зразках харчових продуктів і пробах з виробничих приміщень.

Система складається з прозорої полімерної ємності і поміщених в неї двох пробірок, кожна з яких містить свій набір з двох середовищ: селективної (в нижній частині) і індикаторного (у верхній частині), розділених пористою перегородкою. Рідка виборча середовище в полімерній ємності інокуліруегся (від лат. Inoculation - «щеплення») культурою збагачення. В результаті цього рухливі сальмонели мігрують через селективну середу в індикаторну, яка при цьому змінює свій колір. Результат індикації з'являється після 43 год замість 3-5 діб. при стандартному бактеріологічному аналізі.

Найбільший розвиток отримали ферментні і клітинні біосенсори.

Розвиток методів включення живих клітин в полімери і тверді носії призвело до створення відповідних біосеісоров з використанням живих імобілізованих клітин, що володіють унікальними властивостями.

Застосування біосенсорів дуже різноманітно, наприклад, відомі біосенсори для визначення фенолів, проліну, тирозину і інших амінокислот, глюкози, молочної та аскорбінової кислот і т.д. Визначення ВПК води і стічних вод за допомогою біосснсора з іммобілізованими клітинами займає кілька хвилин, а традиційний метод - кілька днів.

Застосування біосенсорів як біологічного компоненті ДНК може радикально змінити діагностику захворювань, особливо на ранній стадії, зокрема, в даний час інтенсивно ведуться роботи але ранній діагностиці серцево-судинних захворювань, схильності до раку і т.п.

Біочіп (від грец. Р юс - «життя» і англ, chip - «уламок», «осколок», «шматочок») - це пристрій для проведення автоматичного багатофункціонального біологічного аналізу. Він являє собою пластину з нанесеним на неї гелем (рис. 9.5), на 99% складається з води, в якому в результаті опромінення через спеціальне сито УФ-світлом і подальшої полімеризації отримують осередки розміром 100x100x20 мкм. На биочипе їх може бути від 600 до кількох тисяч. Розмір самого биочипа в залежності від його призначення може змінюватися від розміру марки до розміру листівки.

Зовнішній вигляд биочипа

Мал. 9.5. Зовнішній вигляд биочипа

Автомат під контролем комп'ютера заповнює осередки різними розчинами, кожен з яких містить молекули-зонди біологічних об'єктів - фрагментів ДНК, бактерій, вірусів і т.д., причому до кожної з молекул приєднано флуоресціююча речовина.

При нанесенні на біочін краплі крові, плазми і т.п. молекули-зонди з'єднуються з «спорідненими» структурами, при цьому речовина елементарної комірки починає флуоресцировать. Так можна пізнавати бактерії, віруси, дефектні гени - будь молекулярне речовина. Оскільки осередків багато, то аналіз проводять відразу за багатьма параметрами, і за зовнішнім виглядом биочипа, сукупності його темних і світяться областей можна судити про його результати. Портрет биочипа можна розглянути в мікроскоп, сфотографувати, відразу ввести в комп'ютер, запам'ятати і проаналізувати, переслати по мережі Інтернет для консультації в будь-яку точку планети і т.д.

Використання биочипов дозволяє зменшити час аналізів в кілька сотень і тисяч раз, підвищити їх достовірність, автоматизувати процес обробки результатів і багаторазово зменшити їх вартість, проводити ранню діагностику і т.п.

 
<<   ЗМІСТ   >>