Повна версія

Головна arrow Медицина arrow УЛЬТРАЗВУК В МЕДИЦИНІ, ВЕТЕРИНАРІЇ, БІОЛОГІЇ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   ЗМІСТ   >>

ЗАСТОСУВАННЯ УЛЬТРАЗВУКУ В МЕДИЧНІЙ І ВЕТЕРИНАРНІЙ БІОТЕХНОЛОГІЇ

Ультразвукові методи дуже перспективні для застосування в біотехнології, так як в залежності від характеру поставленого завдання дозволяють, підбираючи параметри ультразвукового впливу, інтенсифікувати або придушувати ті чи інші фізико-хімічні та біологічні процеси, збільшувати вихід кінцевого продукту і зменшувати витрати сировини, зробити окремі процеси виробництва більш технологічними і створити такі, які без застосування ультразвуку були б просто неможливі.

Ультразвук в кріобіології і кріоконсервуванні

Давно відомо, що при зниженні температури сповільнюються біохімічні процеси, краще і довше зберігаються біологічні тканини. Пошук способів тривалого зберігання життєздатних клітин і тканин привів до розробки ряду нових методів їх консервування холодом і навіть появи нової науки - кріобіології. Успіхи кріобіології відкривають широкі можливості збереження генофонду диких і сільськогосподарських тварин і рослин, консервації і тривалого зберігання їх репродуктивних клітин, збереження клітин крові і кісткового мозку, а також окремих тканин і навіть органів для трансплантації.

Охолодження живих клітин до температур нижче Про ° С супроводжується заморожуванням внутрішньо- і позаклітинної води, що призводить до утворення в клітині і поза її кристалів льоду, виникнення механічних напружень, різкого збільшення концентрації розчинених солей в результаті виморожування чистої води, зміни pH середовища. Ці процеси можуть призвести до порушення структурної цілісності клітин, порушення їх функцій, зміни транспорту речовин через клітинні мембрани і, отже, до зміни складу внутрішньоклітинного середовища. Для захисту клітин від негативних впливів при заморожуванні використовують деякі речовини - кріопротектори, - істотно зменшують пошкодження клітинних і тканинних структур.

Основні порушення в клітинах при кріоконсервуванні обумовлені механічними напруженнями, що виникають в біологічному середовищі при заморожуванні. Отже, кріорезістентность клітин тим вище, чим вище їх стійкість до механічних впливів, а механічну резистентність легко оцінити, використовуючи метод ультразвукових цітолізограмм (див. § 2.4).

При додаванні кріопротектори до середовища фізико-хімічні властивості розчину стабілізуються не відразу і продовжують змінюватися протягом декількох годин або навіть діб до тих пір, поки розчин не стане однорідним. Вплив низькочастотних ультразвуком (35 кГц) потужністю 15 ... 100 Вт істотно прискорює розчинення кріопротектори в рідких середовищах і протягом декількох хвилин стабілізує параметри розчину. Навіть відстоялися протягом тижня розчини кри- опротектівних речовин, наприклад гліцерину або полиетиленоксиду, після ультразвукової обробки стають більш однорідними, про що свідчать результати рентгеноструктурного аналізу їх заморожених зразків. В розчиннику сперми ультразвук диспергирует лецитин зі збереженням його ламелярного структури, що істотно покращує якість розчинника, підвищує його захисні властивості.

Клітини і тканини, поміщені в розчин кріопротектори, повинні витримуватися в ньому до тих пір, поки не буде досягнуто насичення. Час еквілібраціі, т. Е. Період, протягом якого кріопротектори насичують клітку, також може бути скорочено з використанням ультразвуку, так як, збільшуючи проникність клітинних мембран, ультразвук прискорює процес перенесення речовин через ці мембрани.

Ультразвук може бути корисний і для визначення ступеня насичення клітин в суспензії, а також тканин і органів кріопротектор. При перфузії ізольованого органу перед низькотемпературної консервацією розчином кріопротектори вимірюють і порівнюють швидкості ультразвуку в підводиться до органу і відтікає від нього

Ультразвуковий метод контролю ступеня насичення нирки кріопротектор

Мал. 5.6. Ультразвуковий метод контролю ступеня насичення нирки кріопротектор:

V, - швидкість ультразвуку на вході; V 2 - швидкість ультразвуку на виході

розчині (рис. 5.6). Коли відбувається насичення, концентрація кріопротектори і, отже, швидкість ультразвуку в підводиться і відводиться рідини зрівнюються.

При заморожуванні підготовлених для кріоконсервування зразків підбирають такі режими охолодження, щоб утворюються кристали льоду якомога менше травмували клітинні мембрани. Якщо рідина, що не містить зародків кристалізації, повільно охолоджувати, то вона може переохолодитися, залишаючись в рідкому стані при температурах нижче точки замерзання. Цей небажаний для кріоконсервування ефект можна запобігти, заморожуючи зразки в ультразвуковому полі (рис. 5.7). В даному випадку вплив ультразвуку обумовлено збільшенням кількості центрів кристалізації. В результаті в середовищі формується безліч кристалів, розміри яких порівнянні з розмірами клітини. Крім того, кристали льоду ростуть з великим числом розгалужень, що також сприяє виживанню клітин.

Вплив ультразвуку (0,88 МГц) на ступінь переохолодження розчинів кріопротекторів при їх заморожуванні

Мал. 5.7. Вплив ультразвуку (0,88 МГц) на ступінь переохолодження розчинів кріопротекторів при їх заморожуванні

В охолодженому розчині, перш за все, починає промерзати чиста вода, а в незамерзаючих частини рідини швидко зростає концентрація солей, і розчин стає гіпертонічним. В такому середовищі клітини зазнають суттєвих змін: вони зневоднюються, змінюється співвідношення іонів у внутрішньоклітинної середовищі. Інтенсивно перемішуючи рідку середу як всередині клітин, так і поза ними, ультразвукові мікропотоки сприяють рівномірному розподілу солей і зменшують шкідливі наслідки перебування клітин в гіпертонічному розчині.

Якість сперми сільськогосподарських тварин, замороженої в ультразвуковому полі (880 кГц; 0,1 ... 0,2 Вт / см 2 ), після розморожування значно вище, ніж якість сперми, кріоконсервіро- ванній без ультразвукового впливу. Середня активність сперматозоїдів збільшується на 1-2 бали, підвищується абсолютний показник живучості та подовжується проміжок часу, протягом якого сперматозоїди залишаються здатними виконувати свої біологічні функції.

Ультразвукова обробка еритромаси, захищеної кріопротектор (гліцерином або поліетиленоксид), також сприяє підвищенню кріорезістентності клітин.

Клітини кісткового мозку, що містять ядра, так само, як і без'ядерні еритроцити, краще зберігаються при кріоконсервуванні з використанням ультразвуку. Збереження клітин підвищується в міру збільшення інтенсивності ультразвукового впливу до 0Д..0.9 Вт / см 2 . Ультразвук з частотою 880 кГц ефективніше ультразвуку з частотою 2640 кГц. У першому випадку різниця в цілості клітин в контрольних і дослідних зразках становить 12 %, а в другому -9%. Ультразвук з інтенсивністю, що перевищує 0,9 Вт / см 2 , знижує збереження клітин. Ефект пояснюється тим, що поряд з позитивним впливом на процеси кріоконсервування, ультразвук при високих інтенсивностях здатний руйнувати клітини в суспензії.

Процес розморожування при кріоконсервуванні біологічного матеріалу не менш важливий, ніж процес заморожування, так як фізико-хімічні процеси в обох випадках схожі, що дозволяє і тут успішно використовувати ультразвукове вплив.

Розморожування в ультразвуковому полі здійснюється при впливі ультразвуком на контейнери із замороженими клітинними суспензіями, поміщеними в водяну баню з температурою

40 ... 45 ° С. Відтавання продовжують до тих пір, поки температура суспензії не досягне 5 ... 10 ° С. Розморожування в ультразвуковому полі сприяє підвищенню збереження клітин на 20 ... 25%. Ефект обумовлений не тільки мікротеченіямі, які прискорюють теплообмін і знижують температурні градієнти як всередині, так і зовні контейнерів, а й дією ультразвуку, стимулюючим репаративні процеси в клітинах.

Останнім часом зростає інтерес до проблеми кріоконсервування ембріонів людини і тварин. Вирішення цієї проблеми наштовхується на ряд труднощів. Так, дослідження можливості кріоконсервування ооцитів свині виявило їх високу кріочутливості. Пошук шляхів збереження ооцитів при заморожуванні привів до використання ультразвуку низьких інтенсивностей для підвищення їх збереження. Однак лабільні до заморожування ооцити виявилися чутливими до ультразвукового впливу. Найбільш стійкі дрібні, незрілі ооцити без чітко виражених гранул в цитоплазмі. Більш зрілі клітини середніх розмірів, які характеризуються відносно великою розтяжністю, мають підвищену чутливість до ультразвуку.

Найчастіше спостерігається видалення клітин променистого вінця, нерідкі розриви в плазматичній мембрані, деформація ооцитів, часткова дегідратація і інші порушення. Обробка ультразвуком з інтенсивністю 0,05 ... 0,1 Вт / см 2 протягом 0,5 хв в процесі екві- лібрації з кріопротекторів, а також під час розморожування, збільшує морфологічну збереженість законсервованих ооцитів до 65%, в порівнянні з 45 % в контрольних зразках, і сприяє їх подальшому розвитку в культурі.

Аналіз численних даних про вплив низьких температур і ультразвуку на тканини і клітини в суспензії свідчить про значну роль цитоплазматичних мембран у формуванні ряду реакцій біологічних систем на ультразвукове і криовоздействие. Мембранні структури здатні по-різному реагувати на дію кожного фактора, в залежності від його параметрів, і результуючий ефект комбінованого впливу залежить від того, підсумовуються чи ефекти їх впливу або має місце часткова або повна взаємокомпенсації.

 
<<   ЗМІСТ   >>