Повна версія

Головна arrow Медицина arrow УЛЬТРАЗВУК В МЕДИЦИНІ, ВЕТЕРИНАРІЇ, БІОЛОГІЇ

  • Увеличить шрифт
  • Уменьшить шрифт


<<   ЗМІСТ   >>

ВПЛИВ УЛЬТРАЗВУКУ НА БІОМАКРОМОЛЕКУЛИ В РОЗЧИНАХ

У пошуках первинних механізмів біологічної дії ультразвуку нерідко досліджують вплив ультразвуку на властивості простих речовин і біополімерів або в розчинах окремих речовин або груп речовин, або безпосередньо в організмі.

Два методичних підходу - дослідження дії ультразвуку на систему в цілому і на її окремі елементи - доповнюючи один одного, дозволяють оцінити залежність ультразвукової резистентності макромолекул і макромолекулярних комплексів від їх структури і властивостей, а також від властивостей середовища. Крім того, такі дослідження гавкають можливість визначити, якими якостями середовища обумовлено переважаючий вплив одного або декількох факторів з числа тих, з яких складається фізико-хімічну та біологічну дію ультразвуку.

Найкраще вивчено дію ультразвуку на водні розчини амінокислот, підстав, білків і нуклеїнових кислот.

Амінокислоти в поле інтенсивного ультразвуку (10 Вт / см 2 , 0,6 ... 0,8 МГц) протягом декількох годин синтезуються з простіших речовин і самі зазнають суттєвих хімічні перетворення. Однак і низькі інтенсивності ультразвуку здатні помітно змінити їх властивості.

Так, вже при 0,3 Вт / см 2 (0,9 МГц) після 10 ... 15-хвилинної ультразвукової обробки спостерігаються зміни в оптичних спектрах поглинання водних і водно-сольових розчинів фенілаланіну, тирозину і триптофану. Причому, як опромінення ультразвуком розчину амінокислоти, так і розчинення амінокислоти у воді, попередньо підданої дії ультразвуку, призводить до якісно однакових результатів.

Очевидно, що спостерігаються зміни в основному обумовлені взаємодією молекул амінокислот з Н2О2, HNO2, HNO3, що утворюються під впливом ультразвуку в водних, насичених повітрям розчинах.

Відносно малі зміни, виявлені при розчиненні амінокислот в попередньо обробленої ультразвуком воді, пояснюються більш низькою хімічною активністю, зокрема, Н2О2, HNO2 і НИОз, в порівнянні з активністю проміжних продуктів їх утворення.

Тривале опромінення ультразвуком (2,6 МГц; 3 Вт / см 2 ; 3 ч) в присутності повітря призводить до розриву ароматичного кільця в молекулі триптофану. Півгодинна обробка насиченого повітрям водного розчину цистеїну ультразвуком (0,8 МГц 5 Вт / см 2 ) призводить до повного блокування його SH-груп, чого не спостерігається у вільній від азоту середовищі.

Пуринові і піримідинові підстави в розчині також відчувають помітні зміни йод дією ультразвуку. За чутливості до ультразвуку (5 Вт / см 2 , 1 МГц) вони утворюють наступний ряд: ти- мідін - »уридин -> цитозин -> аденін. Порогова інтенсивність, при якій виникають зміни в тимідин і уридин, становить близько 0,5 Вт / см 2 . Насичення розчину закисом азоту N2O повністю пригнічує ефект ультразвукового впливу. Останнє свідчить про радикально-цінною природі ультразвукового впливу, так як N2O є ефективним акцептором вільних радикалів.

Широке використання ультразвуку в медичній діагностиці, терапії та біотехнології викликає гостру необхідність вивчення його впливу на ферменти та інші біологічно важливі об'єкти на молекулярному рівні.

Ультразвук помітно впливає на структуру і функції білків і нуклеїнових кислот. Ці зміни залежать від розмірів і форми молекул, від природи присутніх в розчині сторонніх речовин і параметрів ультразвукового поля.

Білки, що мають компактну, глобулярную форму, менш чутливі до ультразвуку, ніж фібрилярні білки.

Наприклад, повна необоротна інактивація а-хімотрипсину в розведених розчинах (4 Ю " 5 М) під дією ультразвуку з інтенсивністю 2 Вт / см 2 (0,9 МГц) при кімнатній температурі досягається лише в результаті 40-хвилинного впливу.

Передбачається, що інактивація ферменту в основному обумовлена впливом вільних радикалів, що утворюються в опромінюються ультразвуком розчинах. Про це свідчить характер залежності швидкості інактивації а-хімотрипсину від інтенсивності ультразвуку, а також від природи насичує опромінюваний розчин газу (кисень, азот, аргон, вуглекислий газ) і присутності в розчині акцепторів вільних радикалів або інгібіторів вільнорадикальних процесів.

Цистеїн, аланін, лейцин, гістидин, метіонін, валін, глутамін, а також аскорбінова кислота, сиворочний альбумін і глікоген в різного ступеня захищають опромінюваний ультразвуком фермент від руйнування.

Вважають, що ці речовини можуть взаємодіяти з активним центром ферменту, утворюючи подобу фермент-субстратного комплексу, більш стійкого, ніж тільки фермент, до ультразвукового впливу. Однак, швидше за все, ефект обумовлений конкурентним взаємодією цих речовин з вільними радикалами, що утворюються в рідині під дією ультразвуку.

В даний час проведені систематичні дослідження ультразвукової інактивації пероксидази хрону, тиреоїд-пероксидази людини (ТПЧ), каталази печінки бика і уреази соєвих бобів в зв'язку з великою практичною важливістю перерахованих об'єктів в медицині і імунобіотехнології.

Проведені дослідження показали важливу роль молекулярної маси, структури, концентрації ферменту і властивостей середовища (pH, присутність органічних співрозчинники) в кінетиці ультразвукової інактивації биокатализаторов. Особливу роль в інактивації ферментів в ультразвуковому полі грає їх олігомерного структура.

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (Г6ФДГ за класифікатором ферментів 1.1.1.49) міститься у всіх клітинах організму людини і тварин, грає ключову роль в пентозофосфатному циклі, так як постачає відновлений ТРЕБА? Н для синтезу жирних кислот. Саме тому Г6ФДГ була обрана в якості об'єкта для вивчення кінетики її інактивації в водних розчинах під впливом низькочастотного ультразвуку (20,8 кГц) потужністю 53 ... 65 Вт. Ультразвук низької частоти застосовується в біотехнології для дезінтеграції клітинних структур, а також в хірургічній медичній практиці (див. Гл. 4).

Ультразвукова інактивація Г6ФДГ виявляє три чітко виражених стадії: лаг-період, тривалість якого зменшується з ростом щільності ультразвукової енергії в середовищі; друга, швидка стадія, швидкість якої залежить від щільності ультразвукової енергії; третя, повільна стадія втрати активності ферменту.

Ясно, що при підвищенні температури від 36 до 50 ° С Г6ФДГ зазнає термоінактивації. З цієї причини у всіх випадках інактивацію Г6ФДГ під впливом ультразвуку порівнюють з термічної інактивацією ферменту в аналогічних умовах.

Протягом двох годин Г6ФДГ в високих концентраціях термостабильна, але з розведенням ферменту після лаг-періоду його активність різко падає, а сама інактивація характеризується двома стадіями. Лаг-період скорочується зі зменшенням концентрації ферменту, а швидкість інактивації в другій фазі процесу збільшується з розведенням Г6ФДГ, в результаті чого його концентрація знижується з 20 до 3 нМ.

Термоінактивації Г6ФДГ при 39 'С не проявляється при концентраціях 20 і 10 нМ. Однак ультразвук інактивує Г6ФДГ як при цій, так і при більш високих температурах (44 і 50 ° С). Примітно, що при впливі на фермент ультразвуком лаг-період зникає, а швидкості його інактивації різко зростають.

Підвищення концентрації Г6ФДГ при всіх температурах веде до збільшення його стійкості. Ультразвукова складова інактивації ферменту дуже значна і зростає з його розведенням і підвищенням температури.

Зниження швидкості термо- і ультразвукової інактивації ферментів зі збільшенням їх концентрації відомо для пероксидази хрону, тиреоїд-пероксидази людини, тетрамерной каталази печінки бика, гомогексамерной уреази соєвих бобів і ін.

Швидше за все, зниження швидкості термо- і ультразвукової інактивації ферментів зі збільшенням їх концентрації пов'язане з асоціацією молекул білків в агрегати. Ці агрегати більш стійкі до впливу температури і ультразвукової кавітації, яка ініціює у водному середовищі в присутності кисню поява активних вільних радикалів Н0 2 і НО. Характер залежності швидкості ультразвукової інактивації від концентрації в разі олігомерних ферментів - димеризованих Г6ФДГ і тиреоїд-пероксидази людини, тетрамерной каталази і гомогексамерной уреази - може пояснюватися також впливом ультразвуку на ступінь дисоціації субодиничних білків на тримери, димери і окремі субодиниці на відміну від термоінактивації олігомерів, коли дію ультразвуку відсутня взагалі.

Незважаючи на невеликий температурний інтервал, в якому досліджувалася термо- і ультразвукова інактивація ГбФДГ-ази, можна оцінити ефективні енергії активації для сумарного процесу термоінактивації і ультразвукової інактивації ГбФДГ-ази.

Таке порівняння наведено в табл. 3.1, з якої випливає, що у всіх трьох випадках? а кт до точки зламу (36 ... 44 ° С) істотно нижче її значень при більш високих температурах (44 ... 50 "С). При термоінактивації спостерігається збільшення Дна з ростом концентрації

ГбФДГ-ази від 3 до 20 нМ, в той час як у випадку сумарної інактивації для її ультразвукової складової значення? акт проходять через максимум при концентрації ферменту 5 нМ.

З табл. 3.1 слід також, що величини? АК т при концентраціях ГбФДГ-ази 5 ... 20 нМ мінімальні для ультразвукової складової процесу, вище - для сумарної інактивації і істотно зростають при термоінактивації ферменту, т. е. ультразвук знижує активаційний бар'єр трансформації білка. Злами на температурних залежностях свідчать про схожу природу інактивації при термічній обробці білка і впливі ультразвуком.

Таблиця 3.1

Енергія активації (ккал / моль) сумарною термічної і ультразвукової (20,8 кГц; 62 Вт) інактивації Г6ФДГ в 0,1 фосфатному буфері (pH 7,4; 35/50)

концентрація

ГбФДПнМ

Сумарна

інактивація

термоінактивації

ультразвукова

інактивація

до 44 "З

вище 44 'С

до 44 "З

вище 44 ° С

до 44 'С

вище 44 ° С

3,0

8,6

61,4

8,4

70,6

8,8

41,0

5,0

19,6

79,8

21,5

83,8

22,0

47,5

10,0

17,4

71,6

-

139,9

15,4

31,7

20,0

18,7

61,0

-

138,6

13,6

17,5

Інактивація ферментів залежить також від кислотності середовища. Так, ГбФДГ-аза найбільш стійка до ультразвуку і температурі в інтервалі pH = 6 ... 8, в той час як її сумарна, термо- і ультразвукова інактивація помітно зростають при pH = 8,6 і 9,1, т. Е. в області, де фермент проявляє максимальну каталітичну активність і, отже, найбільшу конформаційну лабільність.

Частка ультразвукової складової у сумарній інактивації ГбФДГ-ази змінюється при різних pH середовища і зростає від 26 ... 30% при pH - 8,6 ... 9,1 до 50 ... 60 % при pH = 6,0 .. .7,4. Кінетичні криві, що відображають сумарну і ультразвукову інактивації ГбФДГ-ази, повністю узгоджуються з диссоциативной схемою втрати активності цього субодиничних ферменту.

При підвищенні концентрації Г6ФДГ в розчині існує у вигляді тетрамера з чотирьох субодиниць (? T), який являє собою «димер звичайного димера». У стабілізації зв'язків між димерами головну роль відіграють іонні взаємодії, а між субодиницями в димерах превалюють гідрофобні взаємодії і водневі зв'язку. Мономер ГбФДГ-ази, як правило, каталітично не активний.

Схему інактивації ГбФДГ-ази можна представити таким чином:

де Hi, Е2, Ei і Ледве »- тетрамер, димер, мономер ферменту і його денатурована форма, a ki - константи швидкостей прямих і зворотних стадій.

Передбачається, що лаг-періоду на кінетичних кривих інактивації відповідає дисоціація тетрамера на каталітично активні димери. Очевидно, що відносини активностей А / А про при цьому не зменшуються. 11осле закінчення лаг-періоду дисоціює димер з втратою каталітичної активності.

Дисоціація димера Ег складається з двох стадій - швидкої і повільної, що відбивається у вигляді зламів на полулогарифмических анаморфозах кінетичних кривих сумарної і чисто термічної інактивації. В останній стадії каталитически неактивний мономер ферменту необоротно денатурує.

При ультразвукової кавітації з відносно високими швидкостями генеруються активні радикали АЛЕ, 0 2 , Н0 2 і атом Н, що перетворюється в радикал H62 з частотою зіткнень:

Радикал АЛЕ грає переважну роль в ультразвукової інактивації пероксидази хрону, тиреоїд-пероксидази людини, каталази, уреази та багатьох інших ферментів.

У разі ГбФДГ-ази протягом лаг-періоду продукти взаємодії АЛЕ з амінокислотними залишками ферменту ароматичної природи накопичують, що призводить до дисоціації тетрамера в результаті руйнування електростатичних зв'язків.

Вміст ароматичних амінокислотних залишків у глюко- зо-6-фосфат-дегідрогенази досить велике: 36-50 залишків тирозину (Тир), 40-64 залишку фенілаланіну (Фен), 14-26 амінокислотних залишків гістидину (Гіс) і 8-16 залишків триптофану (Три). Всі перераховані залишки з високими швидкостями реагують з АЛЕ: константи швидкості рівні для Гіс 1,9 • 10 9 , для Тир - 1,2 • 10 10 , для Три - 1,1 • 10 t0 і для Фен - 6,7 • 10 9 М ^ з -1 . Реакції АЛЕ з ароматичними амінокислотними залишками сприяють руйнуванню водневих зв'язків і порушення гідрофобних взаємодій, що призводить до дисоціації димера? 2 до мономера Е з втратою каталітичної активності ГбФДГ-ази.

Оскільки будова активного центру ГбФДГ-ази невідомо, говорити про прямий атаці радикалів НО на амінокислотні залишки в цьому центрі не доводиться.

Відносне вплив вільних радикалів на ультразвукову інактивацію ферментів оцінюється по впливу на цей процес скавенджеров (акцепторів) радикалів НО (манітол, етанол) і інгібіторів вільнорадикальних процесів з ряду поліфенолів і їх полідісульфідов.

Слід зазначити, що при відсутності кавітації ультразвук низьких (терапевтичних) інтенсивностей практично не змінює активності добре очищених ферментів в розчині, тому вплив ультразвуку безпосередньо на активність того чи іншого ферменту не може служити первинним актом взаємодії ультразвуку з біологічною системою.

Якщо білки іммобілізовані, т. Е. Пов'язані з поверхнею клітинних мембран або нерозчинних гранул-носіїв, то ультразвук навіть малих інтенсивностей (0,2 Вт / см 2 , 0,88 МГц) помітно збільшує швидкість ферментативних реакцій. Цей ефект швидше за все обумовлений ультразвуковими МІКРОПОТОК, що перемішують тонкі шари рідини біля поверхні носія і полегшують дифузію субстрату до ферменту.

Молекули фібрилярних білків, на відміну від глобулярних, досить чутливі до ультразвуку. Особливо ті, структура яких не пов'язана жорсткими поперечними зв'язками і може змінюватися при відносно слабких впливах. До числа таких білків відноситься м'язовий білок - актоміозін.

П'ятихвилинне опромінення розчинів актоміозіна як скелетної, так і гладкою м'язів ультразвуком (1 Вт / см 2 ; 0,88 МГц) не знижує їх ферментативної активності, хоча характеристична в'язкість білка і число тітруемих сулемою сульфгідрильних груп, оптичні спектри поглинання розчинів в області 210 .. .350 нм і ступінь спірально- сті білкових молекул суттєво залежать від інтенсивності ультразвуку. Властивість молекул актомиозина утворювати в певних умовах агрегати також змінюється, що відбивається не тільки на в'язкості розчинів білка, але і на скорочувальної здатності актоміозі- нових ниток, приготованих пресуванням поверхневих плівок з опроміненого ультразвуком (0Д..З Вт / см 2 ; 2,6 МГц; 10 хв) актомиозина. Нитки виходять пухкими, неміцними і в присутності АТФ скорочуються в 1,2-1,5 рази менше контрольних.

В'язкість і електропровідність розчинів іншого фібрилярні білка - фібриногену, а також електрофоретична рухливість його молекул змінюються вже в перші хвилини впливу ультразвуком з інтенсивністю 0,2 ... 1,5 Вт / см 2 .

Молекули колагену в водно-сольових розчинах, опромінюваних ультразвуком (0.2 ... 2 Вт / см 2 ; 0,88 МГц; 5 ... 20 хв) при температурі 20 ... 25 ° С, також зазнають суттєвих змін, що виражаються в зміні температури і теплоти денатурації колагену. Ентальпія теплової денатурації 0,3% -ного розчину білка, змінюючись під дією ультразвуку, досягає максимуму при інтенсивності 1 Вт / см 2 .

Аналогічна залежність отримана і при дослідженні зміни коефіцієнта поляризації люмінесценції розчину колагену, опроміненого ультразвуком.

Можна припустити, що ультразвук низької інтенсивності викликає часткову деполимеризацию молекул колагену, а інтенсивності, що перевищують 1 Вт / см 2 , призводять до денатурації білка, причому швидкість денатурації тим вище, чим вище інтенсивність ультразвуку.

У тканинах ультразвук призводить до дестабілізації зв'язків між молекулами колагену і оточуючим матриксом. Короткочасне опромінення кожевойтканини ультразвуком (2 хв) на один-два порядки збільшує кількість матеріалу, що екстрагується з неї колагену. Потужне низкочастотное ультразвукове вплив в 25 разів прискорює разво- локненіе колагенових структур навіть дубленої кожевойтканини, обрізки якої складають відходи шкіряної промисловості.

Користуючись різною чутливістю білків до ультразвуку, можна вибірково, пригнічуючи той чи інший фермент в поліфер- цементних системах, досліджувати їх роль в цих системах.

Молекули ДНК і РНК в ультразвуковому полі (10 Вт / см 2 ; 0,8 МГц) в перші ж хвилини опромінення розпадаються на фрагменти приблизно рівною молекулярної маси. Вплив протягом декількох годин призводить до появи в розчині вільних нуклеотидів. Мабуть, це явище може спостерігатися і тоді, коли ймовірність кавітації невелика або коли в кавітуючими розчині присутні акцептори вільних радикалів, т. Е. Деполимеризация макромолекул нуклеїнових кислот обумовлена в основному гідродинамічними силами, що виникають в ультразвуковому полі. Дійсно, градієнти швидкостей мікропотоків поблизу пульсуючого газового бульбашки по порядку величини 10 4 ... 10 5 з -1 порівнянні зі значеннями градієнтів в гідродинамічних установках, при яких відбувається деградація макромолекул.

При інтенсивності ультразвуку 0,2 ... 1,5 Вт / см 2 (0,9 МГц; 110 ... 120 хв) поряд з фрагментацією спостерігаються більш тонкі зміни, що виражаються в зменшенні міцності зв'язків між нуклеїновими кислотами і білками в нуклеопротеїдних комплексах . Цей ефект спостерігається не тільки при опроміненні ультразвуком суспензії нуклеопротеидов в середовищі, а й при ультразвукової обробки однієї тільки водного середовища з подальшим суспендированием в ній нуклеопротеїдних частинок. В основі цього ефекту, очевидно, лежить хімічну взаємодію між Нуклеопротеїдні комплексами і довгоживучими хімічно активними частинками, що виникають у водному середовищі під дією ультразвуку.

Вплив утворюються в ультразвуковому полі хімічно активних речовин наДНКіРНКне обов'язково обумовлює денатурацію або деградацію макромолекул.

Наприклад, взаємодія нуклеїнової кислоти з NO2 може привести до заміни одного підстави (цитозину) іншим (урацілом). Можливо, ця та аналогічні реакції є однією з причин хромосомних порушень, що викликаються ультразвуком (див. Підрозд. 3.2.4).

Як хімічне, так і механічна дія ультразвуку спостерігається у всіх випадках, коли інтенсивність ультразвуку перевищує поріг кавітації. Однак, еслі'воздействію піддаються низькомолекулярні частки (мономери, т-РНК), то превалює хімічне дію. Коли ж молекулярний вагу частинок великий (ДНК, м-РНК), то основну роль грають механічні сили.

Під впливом ультразвуку змінюються і властивості нуклеопроте- ідних комплексів - еухроматину і гетерохроматина.

Серед безлічі способів дезінтеграції ультразвуковий метод, мабуть, найбільш ефективний, технологічний і стабільний по відтворюваності результатів. Однак не завжди можна ототожнювати властивості досліджуваних речовин в організмі з їх властивостями після виділення за допомогою ультразвукових методів. Тут потрібна розумна обережність. Не слід забувати про можливі хімічних перетвореннях, обумовлених ультразвуком.

 
<<   ЗМІСТ   >>